Trabalho Microscopia - Nivia e Karoline

  

Microscópio Óptico

Dupla: Karoline e Nívia

Microscopia Óptica

     No microscópio óptico, a luz que chega aos nossos olhos para formar a imagem, atravessa primeiro o objeto em estudo. Por isto, o material a ser observado não pode ser opaco.     




      Muitas vezes, para se obter material biológico translúcido o suficiente para ser bem observado ao microscópio, é preciso preparar convenientemente o material que quer estudar. Para isto são feitos cortes muitos finos, de preferência com uma máquina semelhante a um fatiador de presunto, chamada micrótomo. O material a ser cortado recebe um tratamento de desidratação e inclusão em parafina que facilita o manuseio e permite que sejam cortadas fatias muito finas. O processo de técnicas histológicas são descritos com maiores detalhes abaixo.

Esquema da formação da imagem num microscópio óptico. AB –objeto iluminado e colocado sobre a platina; A’B’ – imagem real e invertida,formada ao nível do foco da ocular; A’’B’’ – imagem captada na retina doobservador (na realidade forma-se uma imagem virtual no infinito); F – foco daobjetiva; fobj – distância focal da objetiva; foc –distância focal da ocular.(Adaptado de Mello e Vidal, 1980 citado por Parreira, 2005).

   

Esquema de formação da imagem num microscópio óptico 2.

Técnicas Histológicas

A correta observação do material biológico, em microscopia óptica, implica uma série de procedimentos técnicos prévios, que a seguir se descrevem sumariamente. Estes procedimentos, designam-se genericamente por técnicas histológicas.

A técnica histológica visa à preparação dos tecidos destinados ao estudado à microscopia de luz. O exame ao microscópio é feito geralmente por luz transmitida, o que significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim, é necessária a obtenção de fragmentos dos tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e transparentes.

Muitas são as técnicas utilizadas em histologia. Algumas técnicas freqüentemente são utilizadas em rotinas de laboratórios que proporcionam a visualização das microestruturas dos tecidos.

   * Confecção de Lâminas Histológicas
   *  Coleta do Material
   *  Fixação do material
   *   Inclusão
   *  Microtomia
   *  Micrótomo (tipo “rotativo”) e operação de corte 

   *   Montagem das lâminas histológicas

As fitas obtidas a partir do micrótomo são transferidas para um banho-maria, com o auxílio de uma pinça, para serem distendidas. A água deve estar entre 3° e 8º abaixo do ponto de fusão da parafina utilizada.

Nesta etapa, são retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita. Após a distensão, os cortes são separados individualmente ou em grupos, conforme a conveniência, utilizando se lâminas de vidro previamente limpas com detergente, estocadas em álcool 80% e previamente secas. Antes da utilização das lâminas, é necessário revestir suas superfícies com uma fina camada de albumina para facilitar a adesão da peça.

Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (não mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado. Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60º para secagem entre uma e 24 horas.

Imagem visualizada por Microscopio óptico - Doença de Chagas

Microscópio Eletrônico de Transmissão

         O Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) possui sistemas de iluminação e vácuo que produz feixes de elétrons de alta energia (energia cinética), que ao incidir sobre uma amostra de tecido ultrafina (na espessura de nanométro*), fornece imagens planas, imensamente ampliadas, possuindo a capacidade de aumento útil de até um milhão de vezes e assim permitindo a visibilização de moléculas orgânicas, como o DNA, RNA, algumas proteínas, etc.

       

Esquema de formação da imagem Microscópio

 Eletrônico de Transmissão

A imagem formada é uma projeção bidimensional da amostra, podendo haver sobreposição das linhas e áreas de interesse. A imagem final pode ser de campo claro ou campo escuro, de acordo com o feixe de elétrons selecionado. Cada modo de imagem fornece informações complementares sobre a amostra.

No modo campo claro, uma abertura é acionada no plano focal inferior da lente objetiva que permite a passagem apenas dos feixes diretos, não difratados. As regiões correspondentes a estes feixes surgem escuras na imagem, enquanto que regiões com nenhuma amostra no caminho do feixe aparecem mais claras na imagem; daí o nome campo claro.

Na imagem de campo escuro, o feixe direto é bloqueado pela abertura do plano focal inferior enquanto que um ou mais feixes difratados passam pela lente objetiva e aparecem claros na imagem. Por outro lado, as regiões cujos feixes refratados não foram coletados vão aparecer escuras na imagem. Os feixes difratados têm forte interação com a amostra, fornecendo importantes informações, como defeitos na estrutura e tamanho de partículas.

O Processamento  Básico do Material para Visualização através do MET é o seguinte:
  -  Fixar o material por perfusão e/ou imersão;
  - O fragmento geralmente é embebido em tetróxido de ósmio, depois passa por por processos de lavagens, desidratado em concentrações crescentes de alcool e imerso em resina (apon, araldite...), onde permanece até a polimerização;
  - O excesso de resina polimerizada é retirado para expor o material de estudo e permitir o seu fatiamento no ultramicrotomo**;
  - As fatias ultrafinas são colocadas em telas de cobre ou níquel***, e são contracoradas geralmente com uranila e chumbo;
  - Após a obtenção de fotografias, caso não haja um sistema de captação de imagens para CD-Rom, segue-se com a revelação do negativo, revelação e ampliação das fotografias.
-  Análise dos dados.

Espectro obtido pelo Microscópio Eletrônico de Transmissão

         

Microscópio eletrônico de varredura

 O Microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um equipamento capaz de produzir imagens de alta ampliação (até 300.000 x) e resolução. As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual, pois o que é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao contrário da radiação de luz a qual estamos habitualmente acostumados.
    O princípio de funcionamento do MEV consiste na emissão de feixes de elétrons por um filamento capilar de tungstênio (eletrodo negativo), mediante a aplicação de uma diferença de potencial que pode variar de 0,5 a 30 KV. Essa variação de voltagem permite a variação da aceleração dos elétrons, e também provoca o aquecimento do filamento. A parte positiva em relação ao filamento do microscópio (eletrodo positivo) atrai fortemente os elétrons gerados, resultando numa aceleração em direção ao eletrodo positivo. A correção do percurso dos feixes é realizada pelas lentes condensadoras que alinham os feixes em direção à abertura da objetiva. A objetiva ajusta o foco dos feixes de elétrons antes dos elétrons atingirem a amostra analisada.

As lentes condensadoras têm a função de reduzir a dimensão do feixe de elétrons. Por exemplo, para fontes termoiônicas, a dimensão do feixe, inicialmente de 10 - 50 nm, é reduzida a 1 nm - 1µm ao atingir a amostra.

As lentes objetivas, por sua vez, além de reduzir a dimensão do feixe, são responsáveis por direcionar o feixe na amostra. O ajuste grosso é executado ajustando-se a distância entre a saída da lente objetiva e a amostra. O foco é obtido alterando-se a altura da amostra e o ajuste fino é realizado somente com as lentes objetivas.

Microscopia eletrônica de varredura do azulejo com revestimento bactericida

Para a preparação das amostras de análises são realizadas etapas de britagem, moagem e peneiramento a seco. Primeiramente, as placas das amostras foram britadas e, em seguida, levadas para a moagem, com o auxílio de um pulverizador (Fritsch). Foram adicionadas pequenas quantidades de amostras no recipiente do pulverizador (feito de titânio para evitar qualquer tipo de contaminação das amostras), nas seguintes condições: rotação de 400 r.p.m., durante 2 minutos. Depois de retiradas, as amostras moídas eram dispostas em duas peneiras de 2,360 mm (para retirar as bolas de titânio do pulverizador) e 0,149 mm, respectivamente, e levadas para o Ro-tap, aparelho de agitação, onde ficaram por cerca de 10 minutos, para que houvesse a total separação da amostra nas peneiras. A quantidade de amostra retida acima de 0,149 mm retornava para o pulverizador. Quando toda a amostra se encontrasse abaixo de 0,149 mm, a mesma era homogeneizada, e posteriormente era retirada uma amostra para a análise de MEV e EDS.


Bibliografia

http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/microscopio/microscopio-optico.php
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAW4EAG/tecnicas-histologicas
http://www.unifesp.br/dfisio/fisioneuro/eletronica.htm
http://www.degeo.ufop.br/laboratorios/microlab/mev.htm
http://www.cetem.gov.br/publicacao/serie_anais_XIX_jic_2011/XIX_JIC2011_yasmin_soares_gavioli.pdf